01 样本制备阶段
1.1 样本纯度与浓度控制
A、纯度要求：样本中若含有细胞碎片、脂蛋白或其他杂质，会干扰成像。建议通过超速离心法（如100,000g离心纯化）或试剂盒进一步纯化外泌体513。
B、浓度调整：外泌体悬液浓度建议为5 mg/mL左右，需通过稀释梯度（如25倍、50倍、100倍、200倍）优化成像效果。浓度过高易导致颗粒堆积，浓度过低则难以捕捉目标结构。
C、样本保存与处理：
短期保存：4℃保存不超过1～2天，长期保存需分装后置于-80℃，避免反复冻融导致外泌体破裂。
D、解冻处理：从低温冰箱取出的样本需快速冰上溶解并混匀，防止聚集或降解。
02 铜网处理与样本装载
2.1 铜网选择与预处理
A、推荐使用300目碳支持膜铜网，以增强外泌体吸附效果。
B、清洗铜网：负染前需用去离子水（DI水）清洗铜网，去除残留盐分（盐结晶会干扰导电性和成像）。
2.2 样本滴加技巧
A、用移液枪取5-10 μL样本滴加至铜网表面，静置10-15分钟使外泌体充分吸附。避免滴加过量导致液体溢出或干燥不均。
B、吸干多余液体时，滤纸需从铜网侧边轻触吸液，避免直接接触样本区域。
03 染色与负染优化
3.1 染色剂选择
A、醋酸双氧铀（UA）：效果最佳，但具放射性，操作需佩戴防护设备，染色时间控制在1～2分钟。
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B、磷钨酸（PTA）：更安全环保，但需优化染色时间（0.5-2分钟）和pH值（6.5-7.0）。
3.2 染色常见问题
A、染色不均：可能因样本未充分固定。建议先用2%戊二醛固定样本，再染色。
B、背景过深：染色时间过长或染色剂残留过多，需缩短染色时间并用滤纸彻底吸干。
04 电镜操作与成像分析
4.1 电镜参数设置
A、加速电压通常设为80-120 kV，放大倍数建议为50,000-100,000倍，以清晰捕捉30-150 nm的外泌体结构。
B、避免长时间曝光导致样本损伤，优先使用低剂量模式（Low-dose mode）。
4.2 图像判读要点
典型形态：外泌体应呈茶托状或杯状，边缘有双层膜结构的亮圈。无膜结构的圆球可能为脂蛋白或蛋白聚集体。
4.3 区分干扰物：盐结晶呈规则几何形状，细胞碎片则形态不规则，需通过多区域拍摄确认。
05 常见问题和解决方案
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